2.1.6 Preparación de los medios de Cultivo

2.1.6 Preparación de los medios de Cultivo

Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfológica deseada en un cultivo de tejido in vitro, es la composición del medio de cultivo. El medio de cultivo está conformado por macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales, que ayudarán a obtener, una planta completa, o un órgano vegetal en particular, a partir del explante elegido (en condiciones de asepsia) y algún agente gelificante.

Ejemplo: Preparar 400 mL De Un Medio MS (1x), partiendo de soluciones concentradas de sales y orgánicos a 100x, añadiendo 30g / L de sacarosa y 2.7g / L de Phytagel.  Añadiendo 0.5 ppm / L De A.N.A a una concentración  de 1000 ppm.

Este mismo procedimiento es el que se lleva acabo para todas ( 2) solución de sulfatos, 3) solución de quelatos 4) solución de Po, Bo y  Mo, 5) solución de halógenos  y 6) solución de orgánicos) las soluciones por lo que no es necesario repetirlo.

  7)  A.N.A  

  V2 = V1.C1/C2

  V2 = (400 mL)(0.5 ppm)

                 1000ppm

  V2 = 0.2 mL

8) PHYTAGEL

(2.7 g)(400 mL)/ 1000 mL = 1.08 g

 

Estos posteriormente se esterilizan y quedaran aptos para el cultivo in vitro vegetal.

Bibliografía:

http://www.google.com.mx/imgres?q=frascos+con+medios+de+cultivo&.com

2.1.5 Preparación y manejo de soluciones Stock

2.1.5 Preparación y manejo de soluciones Stock

Se denomina solución madre o stock a composiciones concentradas de nutrientes las cuales están formuladas por sales minerales que se emplean en un medio particular. Debido al elevado número de compuestos que incluye y a que algunos de ellos se emplean a muy baja concentración, resulta más práctico preparar soluciones madre o "stocks" concentrados. Esto hace más rápida la futura preparación de medios y minimiza los errores, ya que La composición de una solución se debe medir en términos de volumen y masa, por lo tanto es indispensable conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su concentración.

Componentes de soluciones madres o stock que en conjunto con otros elemento  ( sacarosa, phytagel y hormonas de crecimiento) conforman un medio de cultivo MS.

 

Ejemplo De Los Cálculos De Una Solución Stock.

Preparar 200 ml de solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos a una concentración de 100x.

    Fosfato Monopotásico.  KH₂PO₄

La cantidad utilizada en g/L de este componente es 0.170, esta se multiplica por la concentración que es 100x da como resultado 17 g / L. Después se realizan cálculos mediante una regla de tres para determinar cuantos gramos utilizaran para un volumen de 200 mL, se lleva acabo el siguiente procedimiento:

17 g                              1000 mL

 X                                    200 mL

 

    (200 mL)(17 g)                3400 g/mL

                           =                                           =  3.4 g

   1000 mL                      1000 mL

  Ácido Bórico.   H₃BO₃

6.2 g                              1000 mL

 X                                    200 mL

    (200 mL)(6.2 g)                1200 g/mL

                              =                                    =  1.24 g

   1000 mL                        1000 mL

    Molibdato De Sodio Dihidratado.  Na₂MoO₄.2H₂O

0.025 g                              1000 mL

    X                                     200 mL

    (200 mL)(0.025 g)                5 g/mL

                                =                               =   0.005 g

   1000 mL                         1000 mL

Después de que se tienen los cálculos, en el laboratorio, estos se pesan en la balanza analítica , se disuelven de uno en uno en agua destilada en un matraz de Erlenmeyer a un volumen de 100 mL, después se afora en una probeta graduada a un volumen de 200 mL, se vierte en una botella color ámbar y se guarda en refrigeración.

 BILIOGRAFÍA: 

 * Solución stock/solución madre esl.proz.com…… portugués al español.. Quimica/ciencias/ ing.quim. 8:00 pm 25/02/12

2.1.4 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO

2.1.4 COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO

El medio de cultivo debe tener los nutrientes necesarios para que las células vegetales puedan desarrollarse con normalidad, entre sus componentes encontramos:

SALES INORGÁNICAS

Macronutrientes

·      Los elementos minerales son muy importantes para la vida de las plantas.

·      Nitrógeno (N): forma parte de aminoácidos, vitaminas, proteínas y ácidos nucleíco.

·      Magnesio (Mg): es parte de la molécula de clorofila y de los ribosomas.

·      Calcio (Ca): Es constituyente de la pared celular. Interviene en respuesta de crecimiento.

·      Fosforo (P): Forma parte de las moléculas que almacenan y transfieren la energía química de los ácidos nucleicos, de este depende la energía celular.

·      Potasio (K): Desempeña un papel importante en la regulación osmótica y en la actividad enzimática.

·      Azufre (S): Necesario para sintetizar algunos aminoácidos.

·      Sodio (Na): Es necesario en el cultivo in vitro de halófilas y en plantas cuyos productos fotosintéticos son C4 y plantas con metabolismo acido. (García, 2000).

Micronutrientes

Estos micronutrientes son importantes en las células vegetales, ya que al adicionarles ciertas cantidades excesivamente pequeñas permite que las sales madres sean mas eficaz para el medio de cultivo.

·      Hierro (Fe): forma el núcleo del citocromo y parte de la ferrodoxina.

·      Molibdato (Mo): fundamental para la actividad de la nitroreductasa

·      Manganeso (Mn): induce a la síntesis de clorofila, se requiere para la formación del O2 en la fotosíntesis.

·      Boro (B): Necesario para el sostenimiento de la actividad meristematica, involucrado en la síntesis de bases nitrogenadas como el uracilo.

·      Cobre (Cu): permite la oxidación respiratoria final, esta ligado al proceso de lignificación.

·      Zinc (Zn): requerido para la oxidación e hidroxilación de compuestos fenolicos.

·      Cobalto (Co): componente de la vitamina B12

·      Cloro (Cl): fundamental en reacciones que llevan a la evolución del O2 en la fotosíntesis. (García, 2000).

FUENTES DE CARBONO

Normalmente para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos es necesario adicionar una fuente de carbono en el medio, debido a que el crecimiento in vitro tiene lugar en condiciones poco apropiadas para la fotosíntesis o incluso en oscuridad.

La sacarosa es la más utilizada para propósitos de Micropropagacion.

Generalmente se usan concentraciones de 1 -6% de sacarosa en el medio, aquí es convertida rápidamente en glucosa y fructosa; la glucosa es la que primero se utiliza seguida de la fructosa. El azúcar blanco refinado que se vende en los supermercados puede resultar adecuado para la Micropropagación en muchos casos. Los azucares en el medio cumplen dos funciones esenciales:

— Son fuentes de energía.

— Mantienen en el medio un potencial osmótico determinado.

VITAMINAS

La mayor parte de las plantas sintetizan casi todas las vitaminas esenciales, pero aparentemente lo hacen en cantidades infraóptimas. Para lograr un buen crecimiento es necesario a menudo suplir al medio con una o más vitaminas.

La tiamina (B1) es la que más se utiliza y se la considera un ingrediente esencial. Otras vitaminas también han demostrado tener un efecto positivo en el crecimiento in vitro, como son: pidiroxina (B6), ácido nicotínico (B3), pantotenato cálcico (B5).

AMINOÁCIDOS

Los aminoácidos son usados como constituyentes de compuestos de composición química indefinida o bien por adición directa. De esta manera, se encuentran en caseína hidrolizada, peptona, triptona, lactoalbúmina hidrolizada, extracto de malta, agua de coco, casamina, etc. Los aminoácidos que se emplean directa y más comúnmente son L-glicina, L-glutamina, L-asparagina, L-arginina, L-prolina, ácido glutámico. L-hidroxiprolina, L-alanina, L-lisina, L-leucina, L-serina y L-cisteina. Nitsch y Nitsch (1957) señalan que las formas L de los aminoácidos son más adecuadas para el cultivo de tejidos que las formas -D ya que estas son tóxicas.

REGULADORES DE CRECIMIENTO

Adicionalmente a los nutrientes, generalmente es necesario agregar una o más sustancias reguladoras; frecuentemente Auxinas y/o Citoquininas, pero a veces también Giberelinas o ácido ascórbico, para mejorar el desarrollo del cultivo in vitro de tejidos y órganos. Por otro lado, los requerimientos de estas sustancias varían considerablemente con los tipos de tejidos y los niveles endógenos de estos reguladores, así como con la finalidad del cultivo in vitro.

El uso de fitoreguladores en los cultivos in vitro es de gran importancia por cuanto Se ha demostrado que la clase y concentración de dichas sustancias interactúan con el genoma de la planta. (Montoya, 1991)

·      Auxinas

Son utilizadas principalmente para la diferenciación de raíces y la inducción de callo. Las más utilizadas son:

IBA: (ácido indol-3-butírico) = diferenciación de raíces

ANA: (ácido naftalenacético) = diferenciación de raíces

IAA: (ácido indolacético) = Prolongación de explantes

2,4-D: (ácido diclorofenoxiacético) = inducción de callos.

·      Citoquininas

Promueve la división celular y la inducción de yemas adventicias en callos y órganos. Brotación.

— Las Citoquininas más usadas son:

— BAP: (bencilamino purina)

— Kinetina

— 2-ip (isopentenil-adenina).

(Generalmente son diluidas con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio).

·      Giberelinas

Su función principal es alargar las regiones subapicales del explante. La giberelina con mayor uso es: El GA3: pero se debe tener en cuenta que es muy sensible al calor (pierde el 90% de su actividad después del autoclavado)

Comparado con las Auxinas y Citoquininas, las giberelinas se utilizan raramente. La mayoría de los explantes sintetizan cantidades suficientes de este grupo de hormonas.

·      Acido abscísico

El ácido abscísico (ABA) en la mayor parte de los casos produce un efecto negativo en los cultivos in vitro, pero en determinados casos promueve la maduración de embriones, y en cultivos de células en suspensión facilita la sincronización de la división celular.

AGAR

El agar es un gel que se extrae de algas marinas y que por sus características físicas se emplea para solidificar el medio básico, cuando ses trabaja con cultivo estsacionario sólido o semi-sólido.

AGUA

Es el elementos indispensable ya que se utiliza para para aforar al volumen que se requiera.

BIBLIOGRAFÍA:
http://www.argenbio.org/adc/uploads/pdf/Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf