SEP SNEST DGEST
INSTITUTO
TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
MATERIA: BIOTECNOLOGIA APLICADA
PRACTICA No.2
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES
PROFESOR: MC. FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA
LIC EN BIOLOGIA VIII SEMESTRE
PRESENTAN:
Ma.
Yesenia Balandrano Alonso (08930258)
Diana
Vely García Banderas (08930286)
Anel Mojica Macedo (08930287)
Mayra
Alejandra Nambo Pérez (08930349)
Berenice
Rubí Pérez Sánchez (08930354)
Cd.
Altamirano, Gro. México. 27 de Febrero del 2012
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES
Yeka_rys@hotmail.com;
diana_v_eli@hotmail.com; anel_m89@hotamail.com; may_anp1307@hotmail.com;
melisa992@hotmail.com
RESUMEN
La presente práctica se
realizo en el laboratorio de usos múltiples del Instituto Tecnológico de Cd.
Altamirano Gro. Cuyo objetivo fue conocer los diferentes componentes del medio
de cultivo y su naturaleza Química y Bioquímica, así como manejar las técnicas
básicas a través del uso adecuado de reactivos. Para lo cual se requirió vasos
de precipitados, probetas, agua destilada, frascos ámbar y reactivos para
preparan las distintas soluciones, en nuestro caso se trabajo con la solución de
Fosfatos, Boratos y Molibdatos, para ello se pesaron 4.25 g de KH2PO4,
0.155 g de H3B03 y 0.00625 g de Na2MoO42H2O,
posteriormente se disolvieron en matraz a 100 ml y por ultimo se aforo a 200 ml
con agua destilada. Por lo que se obtuvo una solución de Fosfatos, Boratos y
Molibdatos concentrada a 100X, la cual fue etiquetada y guardada a 4 0C.
Así, esta práctica será de gran utilidad para la preparación de medios de
cultivo, ya que estas soluciones se encuentran concentradas a 100X y su manejo será más fácil y apropiado.
Palabras
clave:medio
de cultivo, reactivos, solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos
Abstract
Thispracticewas held intheMultipurposeLaboratoryTechnological Institute of
CiudadAltamiranoGro. Aims to better
understandthe different components ofculture mediumand the nature ofChemistry
and Biochemistry, and manage the basic
techniquesthroughproper use ofreagents. Whichwas requiredforbeakers,
test tubes, distilled water, ambervialsand reagents
forpreparingthe various solutions, in our case we
workedwith the solution ofphosphates, boratesand
molybdates, for itweighed4.25
gofKH2PO4,0.155gand0.00625gH3B03Na2MoO42H2Osubsequentlydissolved
in100mlflaskand finallydiluted to200mlwith distilled water. Soas to obtain
asolutionofphosphates,boratesandconcentratedMolybdates100X,whichwas labeledand
stored at40C.Thus, this practice will be usefulfor the
preparation ofculture media,as these solutionsare concentratedat 100Xand its
handlingiseasy andappropriate.
Keywords:culture media, reagents, solution ofphosphates,
boratesand molybdates.
ÍNDICE
Pág.
Antecedentes……………………………………………………………....................…….…5
Definición
del problema………………………………………….………...….….............6
Objetivos………………………………………………………………………........................7
Justificación………………………………………………..….……………...…...................8
Fundamento
teórico……………………………...….……………..……………...............9
Materiales y Métodos……………………………………………………......…..............13
Resultados…………………….….………………………………………….......................20
Conclusiones y Recomendaciones...…………………………………………….........21
Fuentes consultadas………...…………………………..…………………….…............22
Anexos…………..……………...………………………………………………....................23
I.
ANTECEDENTES
Un
método de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce
como "soluciones madre" de algunos de estos componentes. Estas
soluciones tienen una concentración que suele ser 10, 100 e incluso 1000 veces
superior a la concentración final del medio. Su ventaja no estriba sólo en el
hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino
también la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos están tan diluidos
en la solución final, que la pesada que habría que hacer estaría por debajo de
los límites de exactitud de las balanzas de precisión.
Las soluciones madre se conservan en frigorífico y en bote
topacio durante algunos meses, desechándose ante cualquier señal de
precipitación.
Se
suelen preparar soluciones madre de las sales minerales, los aminoácidos,
hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente
gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y
no se conservan bien en solución.
En el caso de las hormonas es mejor preparar una
solución madre de cada una de ellas y medir volúmenes determinados y
congelarlos en un frigorífico de 4 estrellas.
II.
DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Para
la preparación de soluciones madres (medio de cultivo) se debe cumplir con una
serie de normas, esto es para cualquier combinación ya que si no se cumplen
como se debe el resultado no será exitoso, sino un total fracaso y de ser así
nuevamente se realizaría la preparación del medio de cultivo. Es por ello que
se debe tener un orden y sobre todo mucha concentración al preparar el medio, pero
cabe mencionar que se requiere de un mayor número de balanzas analíticas debido a que el
laboratorio solo cuenta con 2 y 2 no son
suficientes ya que se pierde tiempo al esperar que se desocupen las balanzas
para continuar con el proceso de preparación.
III.
OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Conocer los
diferentes componentes del medio de cultivo y su naturaleza Química y
Bioquímica.
3.2 Objetivos específicos
Ø Manejar
las técnicas básicas a través del uso adecuado de reactivos.
Ø Comprender
la importancia nutricional de los componentes de los medios de cultivo.
IV.
JUSTIFICACIÓN
Esta práctica se
realizó con la finalidad de conocer los
diferentes componentes de un medio de cultivo así como su naturaleza química y
bioquímica aunado a esto nos ayudo aprender a determinar los valores y la composición
de una solución Stock, ya que se debe medir cuidadosamente en términos de
volumen y masa, por lo tanto es indispensable conocer la cantidad de soluto
disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su concentración,
debido a que durante el desarrollo de cualquier trabajo experimental
relacionado con la propagación in vitro de explantes vegetales, el uso de
soluciones Stock se hace indispensable, ya que estas comprenden el balance
nutricional de los componentes de un medio de cultivo por lo que es necesario
conocer los procedimientos para su elaboración.
V.
FUNDAMENTO TEÓRICO
5.1
MEDIO PARA CULTIVAR MATERIAL VEGETAL
Son muchos
los elementos de un medio para cultivar material vegetal in vitro:
- Sales
minerales que incluyan todos los elementos esenciales tanto micro como
macronutrientes
- Vitaminas
tales como rivoflavina, tiamina, piridoxina, acido nicotínico, acido
pantotenico, biotina y acido fólico
- Aminoácidos
tales como L-glutamina, asparagina y cisteína
- Hexitoles
como mio-inositol
- Hormonas
y reguladores de crecimiento
- Fuente
de carbono
- Agente
gelificante
5.2 SOLUCIONES MADRE
Estas
soluciones tienen una concentración que suele ser de 10, 100 e incluso 1000
veces superior a la concentración final del medio. Su ventaja no estriba solo
en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio
sino también la exactitud de la pesada ya que algunos compuestos están diluidos
en la solución final, que la pesada que habría que hacer estaría por debajo de
los límites de exactitud de las balanzas de precisión.Las soluciones madre se
conservan en frigorífico y en bote topacio durante algunos meses, desechándose
ante cualquier señal de precipitación.
Se suelen
preparar soluciones madre de las sales minerales. Aminoácidos, hormonas,
vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el agente
gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y
no se conservan bien en solución; Enel caso de las hormonas es mejor preparar
una solución madre de cada una de ellas y medir volúmenes determinados y
congelarlos en frigoríficos de 4 estrellas
Las
soluciones deben prepararse con mucho cuidado y precisión. Las sales deben
pesarse en una balanza granataria (precisión= 0.01 g) y en la balanza analítica
se pesaran las vitaminas y reguladores de crecimiento (precisión = 0.0001 g).La
conservación de las soluciones madres se hará de 4-5 C. en el refrigerador, es
recomendable no prolongar por más de tres meses la conservación de las
soluciones madres de sales minerales. Las que contengan vitaminas y sustancias
de crecimiento estables podrán conservarse un máximo de 4 semanas.
5.3 FORMULACIONES PARA PREPARACION DE SOLUCIONES
MADRE
Sales minerals MS (g/l)
(NH4 )NO3 1.650
KNO3 1.900
CaCl2.2H2O 0.440
MgSO4.7H2O 0.370
KH2PO4 0.170
FeSO4.7H2O
0.0278
Na2EDTA.
2H2O 0.0372
MnSO4.H2O 0.0169
ZnSO4.7H2O 0.0086
H3BO3 0.0062
KI 0.00083
Na2MoO4.2H2O 0.00025
CuSO4.5H2O 0.000025
CoCl2.6H2O 0.000025
Mioinositol 0.100
Tiamina HCl 0.0001
Acido nicotínico 0.0005
PiridoxinaHCl 0.0005
Glicina 0.002
5.4 NORMAS GENERALES A LA HORA DE PESAR
-
Comprobar los cálculos. Y tener en cuenta que los valores de las
soluciones madre están expresados para un litro
-
Leer las características del reactivo que se va a pesar. Algunos son
tóxicos por inhalación o en contacto con la piel y hay que mantener las debidas
precauciones.
-
Desde 0.01 g se utilizará la balanza
granataria. Para valores inferiores la balanza de precisión.
-
Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se está haciendo la
pesada. Nunca se debe pesar directamente sobre el platillo de la balanza.
-
Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo
hay que asegurarse de que esté limpia y seca. Es una precaución que evita la
contaminación de los reactivos
-
Hay que tener la precaución de tomar del frasco de reactivo muy poca
cantidad de modo que en la medida de lo posible se evite devolver al frasco
parte de lo que se tomó.
5.5 NORMAS GENERALES A LA HORA DE PREPARAR LAS
DISOLUCIONES
-
Si la disolución se va a remover con un agitador mecánico el mejor
recipiente es un vaso de precipitados. Si la agitación es manual, suele ser
mejor un erlenmeyer.
-
Antes de empezar a añadir los solutos se deberá poner un 70% del
volumen total de agua
-
Cuando una disolución incluya más de un reactivo, estos se añadirán
uno a uno y teniendo la precaución de no añadir uno hasta que el otro esté
totalmente disuelto.
-
Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una
probeta, nunca un vaso de precipitados o un erlenmeyer.
-
Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente
etiquetado en el que figuren los siguientes datos:
Tipo de solución. Ej. Macro de MS
-
Grado de concentración. Ej 100 X (100 veces más concentrada que la
solución final)
-
Componentes con fórmula y peso en g/l
-
Fecha de preparación.
VI.
MATERIALES
Y MÉTODOS
Lapractica tuvo lugar en el
laboratorio de usos múltiples
perteneciente al Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano. Para poder dar inicio con los
procedimientos de esta, primeramente se organizaron lo estudiantes en seis
grupos de trabajo, cada grupo prepararon
una solución madre stock de
Murashige&Skoog MS. Nuestro equipo trabajo en la preparación de la solución
de Fosfatos, Boratos y Molibdatos; la práctica se desarrollo de la siguiente
manera:
6.1Cálculos
Para Determinar Los Gramos Necesarios De La Solución De Fosfatos, Boratos Y
Molibdato
Se
Realizaron previamente los cálculos necesarios para determinar los
gramos exactos que se utilizaron de la solución de Fosfatos, Boratos y
Molibdatos.
REACTIVOS
|
||
COMPONENTES
|
NOMBRE
|
CANTIDAD EN g/L
|
KH2PO4
|
Fosfato Monopotásico
|
0.170
|
H3BO3
|
Ácido
Bórico
|
0.062
|
Na2MoO4.2H2O
|
Molibdato De Sodio
Dihidratado
|
0.00025
|
Preparar 200 ml de solución de
Fosfatos, Boratos y Molibdatos a una concentración de 100x
1)Fosfato Monopotásico. KH2PO4
La cantidad utilizada en g/L de este
componente es 0.170, esta se multiplicó por la concentración que fue 100x y nos
dio como resultado 17g / L. Posteriormente se realizaron cálculos mediante una
regla de tres para determinar cuantos gramos utilizaríamos para un volumen de
200 mL, se realizó el siguiente procedimiento:
17 g
1000 mL
X 200 mL
(200 mL)(17 g) 3400 g/mL
= = 3.4g
1000 mL 1000 mL
Teniendo en cuenta que se utilizan 17g
para un litro (el cual es equivalente a 1000 mL) a una concentración de 100x se
multiplico el volumen que íbamos a emplear
200 mL por 17g y se dividió en 1000 mL obteniendo como resultado 3.4g,
este mismo procedimiento se utilizo para los siguientes dos reactivos.
2) Ácido Bórico. H3BO3
6.2g 1000 mL
X 200 mL
(200
mL)(6.2 g) 1200 g/mL
= = 1.24 g
1000 mL 1000 mL
3) Molibdato De Sodio
Dihidratado. Na2MoO4.2H2O
0.025 g
1000 mL
X 200 mL
(200
mL)(0.025 g) 5 g/mL
= =
0.005g
1000 mL 1000 mL
6.2
Procedimiento en laboratorio para la preparación de la solución de Fosfatos,
Boratos Y Molibdatos.
Una vez que se obtuvieron las
cantidades de cada componente se procedió en el laboratorio a buscar cada uno
de ellos en el área de reactivos, posteriormente se peso la cantidad que
necesitaríamos de cada componente en la balanza analítica, se pesó 3.4 g de KH2PO4,1.24
g de H3B03 y 0.005 g de Na2MoO42H2O.
Figura
1. Búsqueda e identificación de fosfatos, Boratos y Molibdatos.
Figura 2. Componentes de la solución de
cada componente de la solución
Figura 3. Pesado de KH2PO43.4
g.
Figura 4. Pesado de H3B03
1.24 g.
Figura
5. Pesado de Na2MoO42H2O
0.005 g
Contando ya con el peso
exacto de cada uno de los componentes, en un matraz de Erlenmeyer se
vertió 100 mL de agua destilada, después se agregó cada uno de los
componentes, para tener la seguridad de que no quedaran residuos de las
sales en los contenedores donde se pesaron se agregó aproximadamente 10
mL de agua para enjuagarlo y se incorporo al matraz, con ayuda de una
pipeta se revolvió la solución hasta que las sales se disolviera
perfectamente en el agua destilada. Se vació en una probeta graduada y
se aforó a 200 mL, finalmente se vertió en una botella color ámbar
previamente etiquetada con los siguientes datos: nombre de la solución
madre, concentración y volumen de la misma, nombre del equipo y fecha de
preparación, esta se tapó y se refrigeró a una temperatura de 9 ºC.
Figura
6.Vertido de
agua destilada en un matraz de Erlenmeyer a un volumen aproximado de 100 mL.
Figura
7. Agregado
de un componente de la solución en agua destilada.
Figura
8. Enjuagado
del contenedor del componente.
Figura
9. Dilución de
los componentes
Figura
10.Vaciado de
la solución
Figura 11. Aforado en probeta a 200 de Fosfatos, Boratos y Molibdatos.
Figura
12. Vertido de solución madre de Fosfatos, Boratos y
Molibdatos en una botella color ámbar
VII.
RESULTADOS
Una
vez calculados los gramos a pesar para la solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos se
obtuvo lo siguiente:
REACTIVOS
|
||
COMPONENTES
|
NOMBRE
|
CANTIDAD EN g/L
|
KH2PO4
|
Fosfato Monopotásico
|
3.4 g
|
H3BO3
|
Ácido
Bórico
|
1.24
g
|
Na2MoO4.2H2O
|
Molibdato De Sodio
Dihidratado
|
0.005 g
|
Así
que una vez disueltos se obtuvo un solución de Fosfatos, Boratos y Molibdatos
concentrada a 100X y lista para la
preparación de medios de cultivo vegetales (MS).
Figura 13. Solución
deFosfatos,
Boratos y Molibdatos (100X)
VIII.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
De acuerdo
a los resultados de la presente practica se concluye que para obtener los
resultados esperados se debe pesar correctamente los reactivos, disolverse en
menos agua de la que se pretende aforar esto porque si disolvemos exactamente
la cantidad de agua con la que se va aforar a la hora de enjuagar el recipiente
la cantidad de agua es mayor y los resultados ya no son los esperados.
De acuerdo
a lo antes mencionado se recomienda que los reactivos se acomoden de forma
correcta de acuerdo a la sales que estos contengan como nitratos, sulfatos,
quelatos, halógenos, etc. esto para encontrar más rápido los reactivos y no
perder tiempo en ello ya que el tiempo de prácticas es muy corto y debe
aprovecharse.
IX.
FUENTES CONSULTADAS
v Pierik R.L. 1991. Cultivo in
Vitro de plantas superiores. 1 Ed. Mundiprensa España
v http://www.rena.edu.ve/cuartaEtapa/quimica/Tema3.html
v http://www.veterinaria-online.com.ar/libros-gratis/preparacion-de-medios-de-cultivo-doc.html
v http://florescienciayalgomas.blogspot.com/2009/07/cultivo-in-vitro-preparacion-de.html
X.
ANEXO
En la práctica realizada nos dimos cuenta que el
laboratorio de biotecnología no cuenta con suficientes balanzas analíticas las
cuales son esenciales para pesar las sustancias a utilizar en los medios de
cultivo.
Fig. 1 Balanza analítica
Otro aspecto importante es que en el
anaquel no se encuentran ordenadas las sustancias, es por ello que se
recomienda que se ordenen de manera alfabéticamente.
Fig. 2 anaqueles
me fue util para realizar mi trabajo, gracias
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