PRACTICA No.3 PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

SEP                           SNEST                           DGEST

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

MATERIA: BIOTECNOLOGIA APLICADA

PRACTICA No.3

PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

PROFESOR: MC. FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA

LIC. EN BIOLOGÍA           VIII SEMESTRE

PRESENTAN:

Ma. Yesenia Balandrano Alonso (08930258)

Diana Vely García Banderas (08930286)

Anel Mojica Macedo (08930287)

Mayra Alejandra Nambo Pérez (08930349)

Berenice Rubí Pérez Sánchez (08930354)

Cd. Altamirano, Gro. México. 27 de Febrero del 2012.

PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

RESUMEN

La presente práctica se realizo en el laboratorio de microbiología del Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano Gro. Cuyo objetivo fue conocer la forma de preparación del medio de Murasshine y Skoog para el cultivo de tejidos vegetales. Para lo cual se utilizó balanza, vasos de precipitados, agitador magnético, y magneto, potenciómetros, frascos limpios para almacenar soluciones, sales y reactivos para preparar las soluciones concentradas y el medio MS, phytagel, hidróxido de sodio y Ácido Clorhídrico para ajustar el pH. En un vaso de precipitados con 100 ml de agua se le agrego 3.5 ml de cada solución posteriormente se agregó 10.5 g de sacarosa para ser aforado a 350 ml en una probeta, posteriormente se vacío a un vaso de precipitados y se ajusto el pH a 5.72 agregando Ácido Clorhídrico, una vez ajustado se agregó 1.05 g de phytagel y se dejo ebullir  en el agitador magnético, por ultimo se dejo enfriar el medio de cultivo y se vacío a los frascos, los cuales fueron guardados en el refrigerador.

Palabras clave: Medio de Murasshine y Skoog, phytagel, Ácido Clorhídrico.

PREPARATIONOFMEDIAFORPLANTTISSUE CULTURE

Abstract

Thispracticewas performed in themicrobiologylaboratoryInstituto Tecnológico de Cd. Altamirano Gro.Aims to better understandhowMurasshinepreparingand Skoogmediumforplant tissue culture.Whichwas usedforbalance, beakers, magnetic stirrer, and Magneto, potentiometers, clean jarsto storesolutions, salts and reagents to preparestock solutions andMS medium,Phytagel, sodium hydroxide andhydrochloric acidfor pH adjustment. Inabeaker with100mlof water wasadded3.5 mlof each solutionthenwas added10.5 gof sucrose tobegraduatedto 350 mlin a test tube, subsequentlyvacuumtoa beakerandthe pHwas adjustedto 5.72addinghydrochloric acid,once adjusted1.05 gwas addedand allowedPhytagelboilon the magnetic stirrer, finally allowed to coolthe culture mediumandvacuumflasks,which werestoredin refrigerator.

Keywords: Middle of Murasshine and Skoog, Phytagel, Hydrochloric Acid.

ÍNDICE

Pág.

Antecedentes………………………………………………………………………….…5

Definición del problema…………………………………………………………...…....6

Objetivos……………………………………………………………………………........7

Justificación…………………………………………………………….…………….....8

Fundamento teórico………………………………………….……………..…………..9

Materiales y Métodos……………………………………………………………......…13

Resultados……………………………………………………………………………....20

Conclusiones y Recomendaciones...……………………………………………….....21

Fuentes consultadas…………………………………………..…………………….….22

Anexos…………………………………...………………………………………………23

I.             ANTECEDENTES

El cultivo de tejido vegetal fue desarrollado a partir de la investigación de botánicos y fisiólogos vegetales desde 1950. Actualmente se ha convertido en una herramienta internacional importante en la selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales y frutales.

La ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigación sobre hormonas que controlan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología por las cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la producción de microorganismos e identificación. Desde estas dos fuentes provino la tecnología por la cual las plantas u órganos de plantas se pueden multiplicar en gran número, o su crecimiento individual controlado, haciendo crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes en un recipiente estéril.

El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de ciencia y arte. Fue considerada inicialmente como una técnica particularmente difícil de aprender. Sin embargo, estas dificultades de los comienzos están hoy en día prácticamente superadas gracias a factores como la disponibilidad de antibióticos, los medios de composición definida, las instalaciones asépticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadoras estériles), dispositivos de cultivo (botellas con tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas).
Los avances técnicos y la aparición de un buen número de compañías comerciales de suministro de medios, sueros, equipo y líneas celulares han hecho del cultivo celular una tecnología con buena reproducibilidad (Reina, 2003).

El cultivo de tejidos, como técnica, consiste esencialmente en aislar una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y

químicas apropiadas para que las células expresen su potencial intrínseco o inducido. Es necesario además adoptar procedimientos de asepsia para mantener los cultivos libres de contaminación microbiana (Roca &Mroginski).

II.           DEFINICIÓN DEL PROBLEMA

En esta presente práctica se busca preparar medios para tejidos vegetales, debido a que es necesario aprovechar lo que la materia y el laboratorio nos permite a través de experimentos para desarrollar nuestras inquietudes. Cabe mencionar  que se requiere conocer exactamente la cantidad de cada uno de los compuestos que hay en el medio, es por ello que se debe conocer paso por paso la preparación del medio.  

III.         OBJETIVOS

3.1 Objetivo general

Ø  Conocer la forma de preparación de los medios de Murasshine y Skoog y B5 (o de Gamborg) para el cultivo de tejidos vegetales

3.2 Objetivos específicos

Ø  Comprender la función de cada uno de los componentes de un medio de cultivo

Ø  Comprender  la importancia que tiene la preparación de los medios para tejidos vegetales.

IV.        JUSTIFICACIÓN

Esta práctica se realizo con la finalidad de conocer los componentes de los medios de cultivo así mismo como la cantidad que se requiere de cada uno de las sustancias utilizadas en la preparación de estos. Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.

V.          FUNDAMENTO TEORICO

5.1 MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos,  estos medios son esenciales en el laboratorio por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegurar la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. En los laboratorios se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma líquida o en forma sólida. Usualmente para preparar un medio sólido, se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le añaden organismos) y a continuación incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo axénico o puro contiene un único tipo de microorganismos. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. También se añaden colorantes que actúan como indicadores.El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios. Sedisuelve completamente a 100°C y se solidifica al enfriarse a 40°C. (Clavell, 1992).

5.2 CLASIFICACION DE MEDIOS DE CULTIVO

De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

• Líquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulación.

• Semisólidos: Contienen 0.5% de agar en su formulación.

• Sólidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulación.

De acuerdo a su composición, los medios de cultivo pueden clasificarse en:

• Definidos: es aquél medio de cultivo del cual se conoce su composición exacta. Son muy utilizados en estudios fisiológicos. Los medios mínimos son medios definidos que únicamente le proporcionan al microorganismo los nutrientes necesarios para crecer, pero no para desarrollarse óptimamente.

• Complejos: es aquél del cual no se conoce la composición exacta del medio. Amenudo, los medios complejos emplean sangre, leche, extracto de levaduras,extracto de carne u otras sustancias muy nutritivas pero de las cuales se desconoce la composición química exacta. Estos medios son muy utilizados para cultivar bacterias desconocidas o bacterias de requerimientos nutricionales muy complejos.

Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:

• Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. en ellos no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.

• Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cualitativamente y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación.

De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:

• Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.

• Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos.

• Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. no contienen ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana, permiten revelar características fisiológicas de los microorganismos.

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados), generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.(Gutiérrez, 2001).

5.3 ASPECTOS  PARA  PREPARAR DE MEDIOS DE CULTIVO

• prepararlos sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.

• utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica adecuada.

• utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.

• controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca se deben exceder las condiciones señaladas por el fabricante.(Gutiérrez, 2001)

5.4 ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que señale el fabricante, generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25°), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.

Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8º C, amenos que el medio requiera alguna condición diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerradospara evitar su deshidratación. Cuando se usa tapón de algodón se debe colocar por encima una envolturade papel (Craft). (Dugas, 1999).

VI.        MATERIALES Y METODOS

La practica tuvo lugar en el laboratorio de Microbiología perteneciente al Instituto Tecnológico de Cd.  Altamirano. Para la preparación de 350 mL de medio M.S partiendo de soluciones concentradas de sales y orgánicos a 100 x,  añadiendo 30 g / L de sacarosa y 3 g / L de phytagel, se llevo acabo la siguiente metodología.

Primeramente se realizó un flujo para saber la cantidad  exacta que se agregarían de cada una de las soluciones stock y los componentes como sacarosa y phytagel.

PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO M.S
FLUJO	L	350 ML
SOLUCIÓN DE NITRATOS	10 mL	3.5 mL
SOLUCIÓN DE SULFATOS	10 mL	3.5 mL
SOLUCIÓN DE QUELATOS	10 mL	3.5 mL
SOLUCIÓN DE Po Bo Mo	10 mL	3.5 mL
SOLUCIÓN DE HALOGENOS	10 mL	3.5 mL
SOLUCIÓN DE ORGÁNICOS	10 mL	3.5 mL
SACAROSA	30 g	10.5 g
PHYTAGEL	3.0 g	1.05 g

Posteriormente se colocaron las seis soluciones stock sobre la mesa del centro del laboratorio, al lado derecho de cada botella que contenía la solución, se encontraba una pipeta correspondiente a cada una de ellas.

 

Figura 1. Soluciones stock concentradas a 100 x.

En un vaso de precipitados de 500 mL o un litro, se colocó 100 mL de agua (bonafont), después con la pipeta correspondiente se agregó 3.5 mL de cada una de las seis soluciones stock (Solución de Nitratos, Solución de Sulfatos, Solución de Quelatos, Solución de Po Bo Mo, Solución de Halógenos y Solución de Orgánicos).

 

En un vaso de precipitados de 500 mL o un litro, se colocó 100 mL de agua (bonafont), después con la pipeta correspondiente se agregó 3.5 mL de cada una de las seis soluciones stock (Solución de Nitratos, Solución de Sulfatos, Solución de Quelatos, Solución de Po Bo Mo, Solución de Halógenos y Solución de Orgánicos).

 Figura 2. Toma de  3.5 mL  de                                 Figura 3. Adición de 3.5 m de            solución stock.                                                           solución stock a 100 mL de agua.

Posteriormente se adicionó la sacarosa, de la cual se pesaron previamente 10.5 g en la balanza analítica, con una pipeta se removió hasta que esta se disolviera perfectamente. Después en una probeta de 500 mL se aforó a 350 mL, se realizó un lavado del vaso de precipitados para evitar que quedaran residuos de los componentes del medio. 

Figura 4. Adición de la sacarosa.                                         Figura 5. Aforado a 350 mL.

Una vez aforada la solución se vertió nuevamente en el vaso de precipitados para medir el pH el cual debía de estar en un rango de 5.7 a 6.0, empleando el potenciómetro. En caso de que obtuviéramos un pH bajo, se le agregaría NaOH hidróxido sódico de lo contrario si el pH sobrepasara 6.0 se agregaría HCL ácido clorhídrico 0.1 N.

 

Figura 6. Medición de pH.

Posteriormente se le agregó un magneto al medio y se procedió a calentar en una parrilla calefactora con agitación magnética, a una temperatura de 50 a 70 ºC, se midió la temperatura con un termómetro y una vez alcanzada se agregó 1.05 g de phytagel, esto se hizo poco a poco para evitar que se formaran grumos.

 

Figura 7. Solución dispuesta sobre la  parrilla calefactora.

                                                           
                                                            Figura 8. Toma de la temperatura.

 

Figura 9. Adición del phytagel.

Ya que se implemento el phytagel se incremento la intensidad de calor hasta que hirviera. Después en frascos de cultivo se vertió el medio M.S, con mucho cuidado ya que estaba caliente, tomando la medida de un frasco llenado con agua, al término de llenado de estos se taparon, sellaron cinta plástica y se mantuvieron en refrigeración.

 

 

 

Figura 10.  Procedimiento del llenado , sellado y refrigeración de los frascos con el medio de cultivo M.S.

VII.              RESULTADOS

Para preparar 350 ml de medio MS partiendo de soluciones stock de sales y orgánicos a 100X, se añadieron 30 g/l de sacarosa y 3 g/l de phytagel.

Cálculos necesarios:

Para las soluciones

V1 C1 = V2 C2         V2=V1 C1/C2

V1 = 350 mL           V2 = 350 mL . 1 X/ 100 X

C1=1 X                  V2 = 3.5 mL

 V2=?

C2 =100 X

Para la sacarosa

30 g ------------- 1000 mL

X----------------   350 mL

X= 10.5 g de sacarosa

Para el phytagel

3 g ----------------- 1000 mL

X  ------------------ 350 mL

X= 1.05 g de phytagel

Se midió el pH el cual se encontraba muy acido y se ajusto con la ayuda del acido clorhídrico hasta 5.72.

Figura 11. Ajuste de pH

De los 350 ml del medio Murasshine y Skoog se obtuvieron 15 frascos de 23 ml para el cultivo de tejidos vegetales, los cuales fueron puestos bajo refrigeración.

Figura 12.  Frascos con medio de cultivo.      

 

  

 Figura 13. Refrigeración de frascos.

VIII.            CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Conclusión:

De acuerdo con lo realizado en la presente práctica se concluye que es de gran importancia  preparar adecuadamente los medios de cultivo, añadir la cantidad de solución exacta y disolverla correctamente para obtener los resultados esperados; además de que observamos que la solución stock es mas acida

Recomendaciones:

De acuerdo a esta práctica se recomienda que potenciómetro este calibrado ya que se pierde tiempo en tratar de calibrarlo, que para la posterior practica se le apliquen reguladores de crecimiento al medio de cultivo  ya que en esta práctica no se agregaron.

IX.          FUENTES  CONSULTADAS

v Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales (2da edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela

v Sofía Gutiérrez de Gamboa, Octubre 2001. http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Preparaci%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf

v Dugas Beverly Tratado de Enfermería Práctica Nueva Editorial Interamericana México, 1999. http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-de-Medios-de-Cultivo

v Biotecnología Vegetal  (cultivo de tejidos, manual )Gonzalez, Cruz, Camarillo, Silos. 2000. SEP. 133p.

v La Ingeniería Genética y sus Aplicaciones. Pellon. Acribia. 1986. Mexico. 237 p.

v Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering. Nair. Infinity Science Press. India. 2008. 791 p.

v http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/CultivoTejidos.pdf

X.         ANEXOS

Es necesario que el laboratorio cuente con medidores de pH  debido a que con los que cuenta el laboratorio no se encuentra en buenas condiciones y no están calibrados correctamente.

Figura 14.  Medidores de pH.