lunes, 26 de marzo de 2012

PRACTICA No.4 SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)


SEP                                            SNEST                              DGEST

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

MATERIA: BIOTECNOLOGIA APLICADA

PRACTICA No.4

SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)

PROFESOR: FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA

LIC. BIOLOGIA                         VIII SEMESTRE
 
PRESENTAN:

Ma. Yesenia Balandrano Alonso (08930258)
Diana Vely García Banderas (08930286)
Anel Mojica Macedo (08930287)
Mayra Alejandra Nambo Pérez (08930349)
Berenice Rubí Pérez Sánchez (08930354)

Cd. Altamirano, Gro. México. 23  de marzo del 2012.


SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)

RESUMEN
La presente práctica se realizó en el laboratorio de microbiología del Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano, Gro. Cuyo objetivo fue conocer el manejo apropiado del material vegetal en cámara de flujo, así como la asimilación de habilidades en la siembra. Para lo cual se utilizó papel higiénico, pinzas, bisturíes, cajas de Petri estériles, tapabocas, mechero, alcohol al 70% y 100% y agua destilada. Se preparó la cámara de flujo laminar desinfectando con alcohol en su interior, posteriormente el material vegetal y los medios preparados se transfirieron en la cámara, después se esterilizó  el material vegetal con alcohol y agua y posteriormente se sacó en una caja de Petri donde se dividió en partes pequeñas, posteriormente se sembró el material vegetal en cada uno de los frascos de medios de cultivo sellándolos completamente cada uno, una vez que se sellaron fueron guardados en un anaquel para su optimo crecimiento.



Palabras clave: material vegetal,  cámara de flujo laminar, medios de cultivo, siembra.




SUBCULTURE (PLANTING MATERIALANDESTABLISHEDIN -VITRO)
SUMMARY

Thispracticewas conducted in themicrobiology laboratory of theTechnological Institute of CiudadAltamirano, Guerrero. Aims to better understandthe proper handlingofplant materialflow chamberand theassimilationof skillsin planting.Whichwas usedfortoilet paper, forceps, scalpels, sterilePetri dishes, masks, cigarette, alcohol 70% and 100% and distilled water.Was prepared inthelaminarflow chamberdisinfectedwith alcoholin its interior,andsubsequentlythe plant materialprepared mediawere transferredinto the chamber,afterthe plant materialwas sterilizedwith alcohol andwater and thenpulledinaPetri dishwhichwas dividedinto small parts, thenthe plant materialwas plantedineachculture mediabottlescompletelysealing themeachoncesealedwere kepton a shelfforoptimalgrowth.



Keywords: Plant material, laminar flow chamber, culture media, plant.







ÍNDICE
                                                                                                                 Pág.

I.Antecedentes………………………………………………………………………….…5
II.Definición del problema……………………………..…………………………...….…7
III.Objetivos……………………………………………………………………………..….8
IV.Justificación………………………………………………………….…………….......9
V.Fundamento teórico……………………………………….……………..……………10
VI.Materiales y Métodos…………………………………………………………......….15
VII.Resultados  y discusión…..………..…………………………………………….....22
VIII.Conclusiones y Recomendaciones………..……………………………………..25
IX.Fuentes consultadas……………….……………………..……………………....…26
X.Anexos………………………………...……………………………………………….27











I.ANTECEDENTES
El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos vegetales, es una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de variables físicas y químicas controladas en un medio de cultivo.  A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes de plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de plantas libres de patógenos; plantas homocigotas, en la producción de plantas en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. El enorme potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos 25 años se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos en el país para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales al lo que ha motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa viable en sus programas de producción (Kite, L., 1983)
La década de los 70 puede considerarse la “década prodigiosa” del cultivo in vitro en España. De esta época saldrán los líderes que serán los responsables de los grupos más consolidados del cultivo in vitro. Líderes que, de alguna forma y porque la historia así lo quiso, completan su formación en las dos escuelas del cultivo in vitro de entonces. De una parte, destaca el Dr. White en USA que, en 1934 publica el cultivo indefinido de la raíz de tomate; por otra, merece mención especial Gautheret, en Francia que, en 1939 publica por vez primera el cultivo indefinido de callos de zanahoria. Las dos “escuelas” utilizan el cultivo in vitro como herramienta de trabajo pero mientras los americanos tratan de utilizarla como una metodología para resolver problemas reales que les preocupan, la “escuela” europea trata de utilizar el cultivo in vitro como una herramienta que le permita conocer aspectos fundamentales de la histodiferenciación celular. En aquella época las diferencias eran tan notables que mientras los europeos cerraban sus tubos de cultivo con algodón y “papel de estaño” (que era como se le llamaba entonces al actual albal) los americanos lucían en sus gradillas el colorido multicolor de los famosos Kap-uts de Bellco (Antonio Ballester, 1999).
En octubre de 1994, se inició la operación de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales in vitro, en el Colegio Profesional de Biólogos del Estado de Veracruz A.C. con la finalidad de desarrollar técnicas para la propagación de especies vegetales de interés ecológico y económico. En enero de 1995, se iniciaron las labores de siembra de tejidos en especies ornamentales de interés económico en la región. A la par de estas actividades, se ha hecho promoción del proyecto en los medios de comunicación locales con el fin de dar a conocer al público las ventajas de utilizar la técnica mencionada para la propagación de plantas ornamentarles difíciles de obtener por los métodos tradicionales., (Davies R.D. et al, 1980)
La totipotencialidad celular fue enunciada como teoría por Gottlieb Haberlandt en 1902, quien propuso que todas las células vegetales tienen la capacidad de regenerar plantas completas.[] Haberlandt no llegó a demostrar su hipótesis debido a que no pudo lograr la división celular ya que los medios de cultivo que empleaba no incluían reguladores del crecimiento debido a que esos compuestos eran desconocidos en ese momento. [] Recién en 1934, Philip White pudo mantener, en forma ilimitada, el crecimiento de raíces en medios líquidos a partir de ápices del tallo de tomate.[] Al mismo tiempo se identificó el ácido indol acético (AIA), que posibilitó el mantenimiento indefinido de callos de zanahoria y tabaco in vitro. Posteriormente se descubrió el efecto de la leche de coco como estimulante de la formación de callo sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. En 1948 Folke Skoog y Cheng Tsui, trabajando con cultivos de callo de tabaco, demostraron la existencia de una regulación química en la parte aérea y en la raíz. Trabajos posteriores en callos de la misma especie, con el agregado de cinética, la primera citocinina descubierta, permitieron demostrar que la diferenciación de brotes, raíces o de ambos, estaba regulada por el balance de auxinas y citocininas  (Mroginski, Sansberro y  Flaschland,  2010)

II. DEFINICION DEL PROBLEMA

En esta presente practica se realizo la  siembra de  los explantes de yuca  de manera adecuada para que no se contaminen con bacterias y hongos y se puedan desarrollar las plántulas de manera libre y logre crecer para extraerlo y cultivarlo nuevamente a un medio de cultivo in vitro. Cabe mencionar que se requiere mucho cuidado al realizar la siembra de los explantes ya que si no se realiza una buena siembra el cultivo se contaminara esto debido a que es posible que el explante traiga una cepa de hongo o bacteria o que el cloro utilizado no fue muy eficiente.






















III. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL
v Conocer la forma de establecer un medio de cultivo  y la forma de sembrar los explantes en el medio de cultivo.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
v Conocer el manejo apropiado del material vegetal en cámara de flujo Yuca: Manihot esculenta).
v Asimilación de habilidades en la siembra.












IV. JUSTIFICACION

Esta práctica se realizo con la finalidad de saber cómo sembrar un explante ya que debido a esto se realizara en un medio de cultivo en el cual será sembrado un explante de yuca (Manihot esculenta)   con la finalidad de que logre crecer libre de enfermedades. La siembra se realizo en la campana laminar la cual se preparo y fue desinfectada con alcohol al 70° para estar libre de contaminantes y se desarrollen los expalntes.














V. FUNDAMENTO TEORICO

5.1 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explante o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u organos, se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquimicos, ingenieria genetica, mutación y selección celular, producción de semillas sinteticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal. (Flaschland, 2010).
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir del explante original depende de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callos, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos,raices, bulbos u otros órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico, protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo que se gane la entrada al mismo crecerá oportunísticamente a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos. Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es «cultivar los tejidos», deben proveerse además ciertos requerimientos externos. Los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio líquido. Los tejidos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y una mezcla de hormonas vegetalesque se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares. Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en general es necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más que de la fotosintesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz. (Neumann, K.H. 1997).
5.2 BASE BIOLÓGICA
La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que, en general, las células de una planta poseen la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametos. Esta capacidad se denomina totipotencia celular y es característica de un grupo de células vegetales conocidas como células meristematicas, presentes en distintos órganos de la planta. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica) para generar tejidos nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta. El éxito en la propagación de una planta depende de que se logre la expresión de la potencialidad celular, es decir, de que algunas células recuperen su condición meristemática. Para ello debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la rediferenciación celular. En condiciones naturales, un proceso de este carácter sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación de yemas adventicias o cuando se busca la propagación de cualquier planta. Entre los factores más importantes para lograr la respuesta morfogenética deseada se encuentra la composición del medio de cultivo. En todo intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del proceso de diferenciación está regulado por el balance hormonal propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores de crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la micropropagación de una planta. (Haberlandt, G. 1902).

5.3 ETAPAS DEL PROCESO
El cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explante y termina con la obtención de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas, las cuales se enumeran a continuación:
  • Elección de la planta y/o tejido donante de explantes. En esta fase se incluyen los tratamientos, preparación y selección de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patógenos, deficiencias o estrés).
  • Establecimiento: consiste en la desinfección de los explantes (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirán ventajosamente con el explante.
  • Multiplicación: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.
  • Enraizamiento: es el proceso de inducción de la formación de raíces con el fin de convertir a los brotes o embriones somáticos en plántulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. Esta operación se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una solución concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosíntesis para obtener la energía necesaria para desarrollarse y formar las raíces.
  • Rusticación: es el paso de aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algún sustrato inerte.
El enraizamiento ex vitro permite que la fase de enraizamiento y la fase de aclimatación se logren simultáneamente y que raramente se forme callo en la base de los explantes, asegurando así una conexión vascular, continua entre el vástago y la raíz. (Hicks G.S. 1980).

5.4 TIPOS DE MORFOGÉNESIS

En condiciones de cultivo in vitro, las células somáticas pueden regenerar embriones o bien, brotes, raíces y/o flores. La embriogénesis somática y la organogénesis son dos procesos morfogénicos muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales. La embriogénesis somática es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar a un embrión cigótico sin que medie la fertilización de las gametas, mientras que por organogénesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores. Estos órganos se obtienen a partir de una célula o de un grupo de células a través de un complejo proceso denominado regeneración. La regeneración comprende diferentes fases que se suceden de manera similar tanto para la organogénesis como para la embriogénesis somática. Estas fases se denominan adquisición de la competencia; fase de inducción y fase de realización. En la primera fase, las células no responden al estímulo organogénico pero adquieren esa competencia durante una fase de desdiferenciación. En la segunda fase o fase de inducción, las células son receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación directa con el tipo, concentración y combinación de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase de realización, la célula sufre las sucesivas divisiones para formar el órgano determinado. A partir de la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en condiciones de cultivo adecuadas, puede inducirse la formación de nuevos órganos de manera directa, sin la formación de callo. Si la formación es de brotes, raíces o flores se denomina organogénesis directa. Si en cambio se induce la formación de embriones somáticos, este proceso se denominará embriogénesis directa. Si por el contrario, a partir de la siembra de un explante in vitro se observa la proliferación de células en forma desordenada y sin ninguna función predeterminada, se iniciará la producción de callos o suspensiones celulares. La diferenciación de órganos a partir de callos, denominada morfogénesis indirecta, estará condicionada a la previa formación de los meristemoides. (Banner, J. 1936).


VI.MATERIALES Y MÉTODOS

La presente práctica tuvo lugar en el Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano, en el laboratorio de Microbiología.
Se inicio con la desinfección de la campana de flujo laminar con alcohol preparado anteriormente al 70%. Los materiales vegetales y los medios preparados se introdujeron en la cámara, las manos se desinfestaron con alcohol al 70 %, después de secarlas completamente, se inició con el trabajo dentro de la cámara, la superficie de los recipientes con medio de cultivo se limpiaron con papel higiénico impregnado con alcohol (normalmente no se utiliza algodón, puesto que se llena de polvo fácilmente). 

 
 
Figura 1. Desinfección de la campana          Figura 2. Introducción de       materiales            de flujo laminar.                                                             y medios en el área de trabajo.

 Previamente se preparó cloralex al 2 % en un frasco, donde posteriormente se introdujeron los explantes dentro con ayuda de las pinzas, permanecieron ahí durante 5 minutos, se agitaba periódicamente.



Figura 3. Preparación de cloralex al 2 %.          Figura 4. Desinfestación de explantes.



 
Figura 5.  Explantes  vegetales en cloralex al 2%.



Se colocaron dos frascos con agua  y un frasco con alcohol del 96%, los cuales se utilizaron para el lavado. La pinza que se utilizó anteriormente para poner los explantes en el frasco del cloralex se mete en el frasco del alcohol al 96%, se flameo para eliminar algún tipo de hongo o bacteria, y se dejó enfriar en un frasco vacío, esto se llevó a cabo al término de ser utilizado un material como pinza o bisturí.


Figura 6.  Frascos con agua estéril.                             Figura 7. Desinfección de material.



 Figura 8.  Frasco portador de materiales desinfectados.

Ya transcurridos los 5 minutos, en un vaso de precipitados se vertió el cloro que contenían los explantes y se realizó el lavado con agua estéril, se mantuvieron ahí durante un minuto, transcurrido ese tiempo se vertió el agua al vaso de precipitados y se inició con el lavado de 5 minutos, se retiro el agua nuevamente, terminado esto, se retiraron los frascos que fueron utilizados para mantener limpia el área de trabajo.















Figura 9. Lavado de explantes con agua estéril.

 Después se colocó el frasco de alcohol, el mechero y los  frascos con pinzas y bisturí, en este orden para evitar accidentes a la hora de la esterilización.








Figura 10. Orden del material para evitar accidentes.
Se utilizó una caja de Petri estéril, se empezó a trabajar en una tapa de esta, obtuvimos dos explantes con ayuda de las pinzas y con el bisturí se cortaron los extremos los cuales fueron dañados por el cloro, posteriormente se diseccionaron los explantes para que cada yema o brote quedaran separados, una vez que se termino, se esterilizaron las pinzas y se colocaron en un el frasco vacío, se tomaron otras frías.
 
Figura 11. Obtención y disección de explantes vegetales.

Se tomo el frasco del medio de cultivo, se quito el sello y tapa la cual se puso sobre otra tapa de un frasco para evitar contaminación, se tomo un explante con las pinzas y se coloco en el medio con cuidando que este quedara dentro del mismo y la dirección de los ápices  hacia arriba de lo contrario se obstruiría su crecimiento, este procedimiento fue el mismo para el cultivo de explantes en el medio de  14 frascos.


Figura 12. Siembra del explante vegetal en el medio de cultivo

Una vez culminada la siembra se sellaron los frascos y colocaron en el área de crecimiento.





Figura 13. Frasco sellado y listo para instalarse en el área de crecimiento.



VII. RESULTADOS Y DISCUSION
Se cultivaron 15 explantes in vitro de Manihot esculenta, de los cuales 5 se contaminaron por hongos en la superficie inferior del explante, lo cual se puede atribuir a que el explante se encontraba contaminado por alguna cepa de hongo o que el cloro ya no era eficiente, pero este factor no perjudico los brotes foliares en el explante.



Figura14. Explantes sembrados invitro.

Figura 15.  Crecimiento foliar del explante.



Figura 16. Crecimiento de explantes.

En la siguiente figura se puede observar el grado de colonización por parte del hongo, observándose como las hifas han alcanzado a distribuirse en toda la superficie del frasco.

Figura 17. Explantes contaminados.

El 33 % de los explantes sembrados in vitro han sido contaminados por la presencia de un hongo.
Según Bregmann y Moon lograron un mayor número de brotes en diversas especies de Paulownia al utilizar reguladores de crecimiento, lograron incrementar el número de brotes cuando los explantes incluían parte del peciolo.
Por otra parte Kadkade y Seibert encontraron que se mejoro la eficiencia tanto para el crecimiento en callo como para la organogénesis al exponer los cultivos a la luz roja durante cinco minutos todos los días.


VIII.CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Conclusiones:

Debido a lo realizado ya antes mencionado en la presente practica se concluye que si la siembra de material in vitro se realiza de forma aséptica: esterilizando el material a utilizar, desinfectándose las manos con alcohol, los resultados son favorables, es decir el material cultivado no se infecta de hongos o bacterias; también se concluye que probablemente la planta que se utilizo (manihot esculenta) estuvo contaminada debido a que el primer día después de la siembra se presento un micelio alrededor del explante.

Recomendaciones:
-       La forma de colocar los frascos en la campana de flujo laminar debe ser frasco con alcohol- mechero - frascos con pinzas para un mejor manejo de material que se utilice.

-       Todo el material a utilizar debe esterilizarse y estar cubierto con papel o aluminio para evitar que este se contamine.


-       Se recomienda que solo se encuentren dos personas: uno para que se encargue de sembrar el material in vitro y el otro para que lo apoye pasándole el material esto para evitar que se infecten los medios de cultivo.

IX.FUENTES CONSULTADAS

v Luis Mroginski, Pedro Sansberro y Eduardo Flaschland. 2010. Establecimiento de cultivos de tejidos vegetales. En: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II, Argenbio, INTA. pags.: 70-84.

v Antonio Ballester, 1999 http://digital.csic.es/bitstream/10261/3975/1/
secivtv.pdf
v Kite, L. (1983), Plant from Test Tubes: an Introductions to Micropropagation. Timber Press Oregon U.S.A.

v Davies R.D. et al, (1980). Proceeding of the Fourth John Innes Symposium the Plant Genoma and Second.

X. ANEXOS
v Se adquirió un anaquel de cinco laminas para adecuar el área de incubación cerca de la campana de flujo laminar y a un lado de la ventana para recibir la poca luz sola que entra.

Figura 18. Anaquel.
 
v Debido a que la luz solar no es la suficiente para todos los niveles del anaquel se requiere hacer la compra de una lámpara para que todos los explantes reciban la misma intensidad de luz.


Figura 19. Lámpara













No hay comentarios:

Publicar un comentario en la entrada